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> Interview mit Katja Bärenfaller, Juli 2003 <
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Worum geht es bei Ihrem Forschungsprojekt?
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In meiner Arbeit beschäftige ich mich mit dem Reparatursystem, das fehlerhafte DNA-Stränge repariert. Fehler können entstehen, wenn das Enzym DNA-Polymerase bei der Verdopplung des DNA-Stranges einzelne Basen falsch eingefügt.
Im Englischen bezeichnet man diesen Reparaturprozess als 'Postreplicative Mismatch Repair' oder einfach ‚Mismatch Repair' (MMR). Die Bezeichnung ‚Postreplicative' bedeutet, dass es sich um eine Fehlerkorrektur handelt, die unmittelbar nach der DNA-Replikation (=DNA-Verdopplung) eingeleitet wird.
Ich möchte herausfinden, welche Proteine an diesem Reparaturprozess beteiligt sind, und wann sie welche Funktion ausüben. Weiter will ich das Zusammenspiel dieser Proteine mit schon bekannten, für die DNA-Verdopplung wichtigen Enzymen aufklären. Schliesslich möchte ich das ganze Reparatursystem wiederherstellen können, d.h. alle beteiligten Proteine separat herstellen und zu einem funktionierenden Ganzen zusammenfügen.
Bei meinem Projekt handelt es sich um Grundlagenforschung. Es besteht kein direkter Bezug zu einer medizinischen Anwendung. Die Aufklärung des Reparatursystems ist aber wichtig, um die bestehenden Lücken im Verständnis vor allem des Dickdarmkrebses zu schliessen. Die Erkenntnisse könnten somit eine Basis für spätere therapeutische Konzepte schaffen.
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Wie gehen Sie bei Ihrer Forschungsarbeit konkret vor?
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Ein Teil meiner Arbeit besteht darin, das eigentliche Untersuchungsmaterial, nämlich fehlerhafte DNA-Doppelstränge herzustellen. Diese müssen an einer genau definierten Stelle, reproduzierbar immer den gleichen Basenfehler aufweisen. An diese fehlerhafte DNA können sich in meinen Versuchen die Proteine des Reparatursystems anlagern. Nach der Anlagerung kann ich die Reparaturproteine dann isolieren. Ein weiterer Teil der Arbeit besteht darin, dass ich die isolierten Proteine im Massenspektrometer untersuche, um deren Identität aufzuklären.
Fehlerhafte DNA-Doppelstränge stelle ich her, in dem ich zwei DNA-Einzelstränge herstelle, die sich in der Abfolge ihrer Basen an nur einer Stelle unterscheiden. Der Unterschied in der Basenfolge besteht darin, dass der eine Strang an einer definierten Stelle eine zusätzliche Base besitzt. Wenn ich die Stränge dann zusammenfüge, bleibt die fehlerhafte Base des einen Stranges ungepaart und verursacht eine Art Knick im Doppelstrang. Diese Stelle wird nun von den Reparatur-Proteinen erkannt. Sie lagern sich an und das ganze Reparatursystem beginnt, den Fehler zu korrigieren.
Um festzustellen, ob die Reparaturproteine meiner Proben funktionieren, schneide ich den DNA Doppelstrang nach der Reparatur genau an der zuvor defekten Stelle entzwei. Dazu benötige ich ein Schneideenzym, das meine DNA an der genau definierten Stelle (Basensequenz) schneidet. Die benötigte Basensequenz ist in meinem Experiment erst dann vorhanden, wenn das Reparatursystem die zuvor fehlerhafte Basensequenz korrigiert hat. Wenn dies nicht der Fall ist, d.h. wenn im einen Strang eine ungepaarte Base vorliegt, dann kann das Schneideenzym die DNA nicht schneiden.
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Wie entwickelte sich die Idee für Ihr Forschungsprojekt?
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Da man weiss, dass Defekte im DNA-Reparatursystem für die Entstehung des vererbbaren Dickdarmkrebses sehr wichtig sind, untersucht man sie hier am Institut für molekulare Krebsforschung. Bevor ich mit meiner Doktorarbeit begann, arbeiteten schon zwei Personen an dem Projekt. So konnte ich z.B. die Methode zur Herstellung der fehlerhaften DNA grösstenteils übernehmen und musste nicht ganz von vorne anfangen.
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Wieso haben Sie sich für dieses Projekt entschieden?
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Ich habe Biochemie studiert. Während meiner Diplomarbeit habe ich ein Protein von Bakterien herstellen lassen, es dann isoliert, gereinigt und untersucht, ob es in vitro (d.h. im Reagenzglas) phosphoryliert und dephosphoryliert wird (Einfügen und Abtrennen von Phosphatgruppen). Die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung ist ein Mechanismus, mit dem ein Enzym aktiviert bzw. inaktivert werden kann. Auch mein jetziges Projekt hat viele in vitro Versuche, bei denen ich mit Proben aus Zellkulturen arbeiten kann und nicht auf die Verwendung von Versuchstieren angewiesen bin. Dies war mir bei der Wahl meines Forschungs-Projektes sehr wichtig.
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Gab es in den letzten Monaten Rückschläge in Ihrem Projekt?
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Der letzte Rückschlag war, dass die reparierte Form meines DNA-Doppelstranges vom Schneideenzym nicht geschnitten wurde und ich somit den Nachweis für die zuvor erfolgte Reparatur nicht erbringen konnte. Irgendetwas stimmte demnach mit meiner DNA nicht. Jetzt muss ich nochmals von vorne anfangen und eine neue Untersuchungs-DNA herstellen, dieses Mal mit einer abgeänderten Prozedur. Zudem habe ich angefangen, mit einer DNA zu arbeiten, die eine neue Sequenz hat und einfacher herzustellen ist. Ich hoffe nun, dass zumindest eine Methode dazu führen wird, dass ich DNA in ausreichenden Mengen zur Verfügung habe, um die nachfolgenden Versuche machen zu können.
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Hat es in Ihrem Forschungsprojekt neue Entwicklungen gegeben, die Ihr Projekt beeinflussen?
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Seit einem Jahr kann ich in Zürich am Functional Genomics Center selber massenspektrometrische Untersuchungen durchführen. Früher wäre das nicht möglich gewesen und ich hätte die Proben zur Untersuchung einschicken müssen. Das ist eine grosse Bereicherung für meine Doktorarbeit, da ich zusätzlich lerne, mit diesen Geräten zu arbeiten. Auch die ICAT-Technologie entwickelt sich rasch und die Fortschritte in dieser Technologie werden meine Arbeit beeinflussen.
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Was möchten Sie in den nächsten Monaten erreichen?
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Ich möchte als nächstes eine funktionsfähige Untersuchungs-DNA zur Verfügung haben. Damit muss ich dann alle Vorversuche machen, so dass ich sicher bin, dass sie ordnungsgemäss funktioniert. Wenn das klappt, kann ich hoffentlich schon bald wieder am Massenspektrometer arbeiten.
Vielen Dank Katja Bärenfaller für das Interview.
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